流式细胞仪的简要介绍与注意事项


发布日期:2014-04-09

一、流式细胞仪的检测范围

1.流式细胞仪可以检测细胞结构,包括:细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。

2.流式细胞仪可以检测细胞功能,包括:细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。

二、流式细胞仪的临床应用

1.流式细胞术在肿瘤学中的应用:流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡;

2.流式细胞术在血液学中的应用:检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞(CD34+)计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测;

3.流式细胞术在免疫学中的应用:可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。

三、流式细胞仪的科研应用

主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。

四、流式细胞术常规检测时的样品制备

(一) 直接免疫荧光标记法

取一定量细胞(约1×106 细胞/ml),直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),孵育20~60分钟后,用PBS(pH7.2 ~7.4)洗1~2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。

(二) 间接免疫荧光标记法

取一定量的细胞悬液(约1X106 细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原-抗体-抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。

五、质量控制和注意事项

流式细胞仪并非是完全自动化的仪器,准确的实验结果还需要准确的人工技术配合,所以标本制备需要规范,仪器本身亦需要质量控制。

(一)流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制

流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用,其免疫荧光染色的标本制备非常重要,常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下:

(1) 确保标本上机检测前的浓度为1X106/ml,细胞浓度过低直接影响检测结果。

(2) 使用蛋白封闭剂,封闭非特异结合位点,尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

(3) 荧光抗体染色后充分洗涤,注意混匀和离心速度,减少重叠细胞和细胞碎片。

(4) 设置对照样品,采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

(5)判定结果时,应注意减去本底荧光,为使免疫荧光的定量分析更精确,应用计算机程序软件,用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值,可以得到更准确的免疫荧光定量结果。

(6) 注意染色后避光,保证细胞免疫荧光的稳定。

(二)DNA倍体分析的质量控制仍没有统一的标准, 各文献报道的实验结果差异较大,1993年10月美国癌症研究组织制定了FCMDNA定的统一标准,我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践,对FCM的DNA分析技术的质控和注意事项进行说明。

(1) 手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时,要避免出血坏死组织。

(2) 标本采集后要及时固定或深低温保存,以免组织发生自溶,DNA降解,而造成测试结果的误差。

(3) 固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度,70%的乙醇固定效果较好。

(4) 单细胞悬液制备过程中,注意将待测细胞成分分离出来,减少其他成分的干扰,并注意不要损伤该群细胞。

(5) 细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度,即1X106/ml,杂质、碎片、团块和重叠细胞应<2%,对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品,至少有20%的肿瘤细胞存在。

(6) 石蜡包埋组织单细胞制备时要注意:取材时应选取无自溶、坏死的组织,对肿瘤组织标本,选取含肿瘤细胞丰富的区域;石蜡组织片的厚度要适宜,**为40~50μm 。过薄或过厚的切片均会影响检测结果;彻底脱蜡,以免残留的石蜡影响酶的消化活性,验证脱蜡是否完全的方法是弃去二甲苯,加入100%乙醇,如果无絮状物浮起,说明蜡已脱净;水化要充分,使组织还原到与新鲜组织相似的状态;注意消化的时间和消化酶的活性。常规使用0.5%胃蛋白酶,pH 1.5。

( 三) 操作方面

(1)流式细胞仪在整个工作过程中处于*佳状态,能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在*小范围,分辨率在**状态,能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。

(2)评价仪器精度的重要指标是仪器的变异系数(CV),对于校准样品,其CV值越小越好,CV值越小,说明仪器校正的精度越高。校准样品包括非生物样品(荧光微球)和生物细胞样品(人淋巴细胞、鸡红细胞等)。目前,非生物荧光微球已有商品试剂,CV一般<2%~3%。

(四) 资料分析方面

(1) 当样品中碎片杂质或团块过多,所测细胞数在20%以下,组方图的基线抬高时,应放弃分析处理。

(2) 做细胞周期分析时,样品细胞数应在1万个,排除碎片、杂质和团块,当异倍体细胞数占总细胞数10%以下时,需要结合其他诊断指标,不可盲目下结论,至少异倍体细胞占总细胞数的20%以上,可以确定异倍体的存在。

(3)DNA分析时,正常二倍体细胞组方图CV值>8%时放弃分析,但肿瘤细胞的CV值>8%,与肿瘤细胞的异质性有关。另外,DNA倍体分析时,同源组织的不同个体会出现10%的漂移。

(4)DNA倍体标准的质量控制,采用相同个体同源正常组织、同样固定方法、相同的样品处理方法、相同的染色方法、同步染色、同样的仪器检测条件、正常的二倍体组织作为内标准。



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